verfasst von PD Dr. Dieter Kaufmann

Restoration of Normal NF1 Function with Antisense Morpholino Treatment of Recurrent Pathogenic Patient-Specific Variant c.1466A>G; p.Y489C

Awad, Moore, Liu, Ciszewski, Lambert, Korf, Popplewell, Kesterson, Wallis

Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant genetic disorder with almost 3000 different disease-causing variants within the NF1 gene identified. Up to 44% of these variants cause splicing errors to occur within pre-mRNA. A recurrent variant in exon 13, c.1466A>G; p.Y489C (Y489C) results in the creation of an intragenic cryptic splice site, aberrant splicing, a 62 base pair deletion from the mRNA, and subsequent frameshift. We investigated the ability of phosphorodiami- date morpholino oligomers (PMOs) to mask this variant on the RNA level, thus restoring normal splicing. To model this variant, we have developed a human iPS cell line homozygous for the variant using CRISPR/Cas9. PMOs were designed to be 25 base pairs long, and to cover the mutation site so it could not be read by splicing machinery. Results from our in vitro testing showed restoration of normal splicing in the RNA and restoration of full length neurofibromin protein. In addition, we observe the restoration of neurofibromin functionality through GTP-Ras and pERK/ERK testing. The results from this study demonstrate the ability of a PMO to correct splicing errors in NF1 variants at the RNA level, which could open the door for splicing corrections for other variants in this and a variety of diseases.

Nachfolgend wird durch Herrn PD Dr. Kaufmann die Herangehensweise und der Erfolg des Projektes beschrieben

In NF1 Zellkulturen kann man die Folgen einer NF1 Spleiß-Mutation durch kleine, spezifische DNA-Moleküle korrigieren

Molekulare Ursache für die Neurofibromatose 1 (NF1) ist eine Mutation im NF1 Gen. Hierdurch wird die Herstellung des NF1 Proteins, Neurofibromin, in den Zellen von Betroffenen gestört. Je nach NF1 Mutation

  • wird entweder gar kein Neurofibromin mehr hergestellt (Nullmutationen), oder
  • es wird ein fehlerhaftes Neurofibromin hergestellt, ohne die normale Aktivität (Missensemutationen), oder als Zwischenform
  • das Spleißen der NF1 RNA wird gestört, sodass eine nicht brauchbare RNA entsteht, die zu keinem oder einem fehlerhaften Neurofibromin führt (Spleiß-Mutationen)

.Bei 44% der NF1 Mutationen funktioniert durch die genetische Veränderung das Spleißen der NF1 RNA nicht mehr regelrecht.

Wenn man über Ansätze zur Behandlung von NF1 nachdenkt, ist die Überlegung naheliegend, ob man nicht irgendwie den Spleiß-Fehler „korrigieren“ kann.

Die direkteste und aktuell noch schwierigste Lösung wäre es, die Mutation in der NF1 DNA der Betroffenen einfach zu korrigieren, und so die ursprüngliche intakte Sequenz wiederherzustellen. Im Prinzip ist das inzwischen durch die Entwicklung der Methode des Gene editing („Genschere“) denkbar. Aber es braucht noch einige Zeit, bis dieser Weg auch praktisch machbar sein wird. Hieran wird geforscht, auch dank der Hilfe von Nothing is Forever e.V.

Eine aktuell besser gangbare und bei einer anderen Erkrankung auch schon etablierte Alternative ist, zu versuchen, den durch die NF1 Mutation ausgelösten Fehler beim Spleißen irgendwie „wieder gerade zu biegen“, sodass trotz NF1 Mutation ein normales Neurofibromin hergestellt werden kann. Um diesen Ansatz zur „Behandlung“ einer dieser NF1 Spleiß-Mutationen geht es in der Arbeit von Kesterson, die Ende 2021 publiziert wurde (J. Pers. Med. 2021, 11, 1320. https://doi.org/10.3390/jpm11121320)

Um es vorwegzunehmen: Seine Arbeitsgruppe hat in Laborversuchen einen Weg gefunden.

Sein Trick ist, dass er in der Zelle die Sequenz der NF1 RNA, die zum Fehlspleißen führt, mit einem bestimmten Molekül „maskiert“. Infolgedessen erkennt der Apparat, der das Spleißen durchführt, diese Mutation nicht mehr und spleißt die RNA normal spleißt, trotz Mutation. Das (Maskierungs) Molekül ist ein spezielles Oligonukleotid, ein PMO (Phosphordiamidat-Morpholino-Oligomer), also eine kleine modifizierte DNA. Dieses Molekül bindet genau an der Stelle der NF1 RNA, die mutiert ist. Und so ist die Mutationsstelle „maskiert“.

Dass dieser Ansatz funktioniert, zeigt diese Gruppe in Zellen, die diese NF1 Mutation tragen. In Gegenwart des speziellen Oligonukleotids (PMO) produziert die NF1 Zelle wieder normales Neurofibromin, also mit der richtigen Länge und der richtigen Aktivität. Die NF1 Zellen verhalten sich wieder wie Zellen von Gesunden.  Es gibt noch viel zu überlegen, aber im Prinzip hat es in kultivierten Zellen geklappt. Der nächste Schritt ist, diesen Ansatz in einer Maus mit dieser NF1 Mutation auszuprobieren und zu verbessern. Ähnliche PMOs werden bei einer anderen Erkrankung schon im Menschen angewendet.

Das war jetzt reichlich viel Expertenkauderwelsch. Also nochmal langsam:

Was sind NF1 Spleiß-Mutationen? Wie funktioniert Spleißen von RNA?

Leider muss ich ein wenig ausholen: Das NF1 Gen ist sehr groß. Praktisch jeder Bereich des NF1 Gens kann mutieren, also verändert sein. Weltweit kennt man inzwischen sehr viele und unterschiedliche NF1 Mutationen. Vereinfacht gesagt könnte man sagen: jede NF1-Familie hat ihre eigene NF1-Mutation.

Von der NF1-DNA zur primären NF1-RNA und zur Herstellung von Neurofibromin

Das NF1-Gen, das ja aus DNA besteht, wird abgelesen. Diesen Vorgang nennt man „Transkription“. Von einem der beiden Doppelstränge der NF1 DNA wird eine einzelsträngige Kopie hergestellt. Man nennt sie NF1 RNA oder „primäres NF1 Transkript“. Sie stellt eine Art Botenstoff zwischen der NF1 DNA und der „Fabrik“ dar, die das NF1-Eiweiß (NF1 Protein, Neurofibromin) herstellt.

Die Protein-Fabrik heißt „Ribosomen“.  Die NF1 RNA liefert den Ribosomen eine Bauanleitung für die Herstellung des Neurofibromins. Neurofibromin ist eine Kette aus Aminosäuren. Und diese Ribosomen setzen dann entsprechend dieser NF1 RNA Bauanleitung aus den 20 unterschiedlichen in den Zellen vorhandenen Aminosäuren das 2838 Aminosäuren große (Eiweiß) Neurofibromin zusammen.

Nachbereitung der primären NF1-RNA, z.B. Spleißen

Die abgelesen einzelsträngige (primäre) NF1-RNA muss aber noch ein wenig „nachbearbeitet“ werden, prozessiert werden. Erst danach ist sie für die Proteinfabrik, die Ribosomen, brauchbar.

Eine dieser Nachbereitungen nennt man „Spleißen“. Dabei geht es um das Herausschneiden von Teilen der NF1 RNA und wieder neu zusammensetzen. Die primäre NF1 RNA besteht nämlich aus RNA Sequenzen, die für diese Fabrik (Ribosomen) brauchbar sind und anderen, die unbrauchbar sind. Die brauchbaren

Anteile sind die sogenannte Exons, die unbrauchbaren Introns. Introns werden beim Spleißen herausgeschnitten, Exons neu zusammengesetzt.

NF1 Exons und Introns

Bei Spleißen werden die für die Ribosomen (Proteinfabriken) unbrauchbaren Anteile (Introns) herausgeschnitten die brauchbaren Anteile (Exons) schön ordentlich und in der richtigen Reihenfolge hintereinander wieder zusammengesetzt. Nur eine RNA ohne intronische Sequenzen können die Ribosomen sinnvoll verarbeiten. Das nur aus exonischen RNA Sequenzen bestehende Molekül nennt man messenger RNA (mRNA, oder „fertige RNA“). Manchmal nennt man diese aus den Exons zusammengesetzte Sequenz auch die „kodierende Sequenz“. Und dies Molekül kann zur Weiterverarbeitung zu den Ribosomen transportiert werden.

Wie kann man sich Spleißen der NF1-RNA vorstellen?

Vielleicht wie eine Kette, auf der in Abständen zahlreiche Perlen mit Abständen auf einem Faden aufgereiht sind. Die „Perlen“ sind brauchbaren NF1 RNA Sequenz-Blöcke, die Exons. Insgesamt 51 gibt es davon bei der NF1 RNA. Die Stücke dazwischen, der „Faden“ der Perlenkette, sind die für die Proteinfabrik unbrauchbaren Introns. Sie werden abgebaut, also verworfen. Um das Herausschneiden dieser Perlen und neuzusammensetzen und „miteinander verkleben“ dieser Perlen geht’s beim Spleißen.

Dazu braucht man einen Spleiß-Apparat: Exons rausschneiden und neu zusammensetzen

Für das Spleißen braucht man eine Art Maschine, den „Spleiß-Apparat“ (Spliceosome). Alles, was die für ein Intron hält, schneidet sie raus, alles, was sie für Exons hält setzt sie neu zusammen. Um es mit einem Bild aus einem Märchen, dem Aschenputtel zu erklären: „die guten (Exons, Perlen) ins Töpfchen (und zusammenkleben), die schlechten (Introns, Faden) ins Kröpfchen (und aufessen)“.

Wie macht der das? Der Spleiß-Apparat tastet sich an der NF1 RNA entlang. Hat er eine Exon-Sequenz (Perle) (nennen wir es mal Exon 1) gefunden, schneidet er die NF1 RNA direkt hinter dem Exon 1 vor dem Intron durch. Das Intron (den Faden) „in der Hand“ macht er sich auf die Suche nach dem nächsten Exon (Perle). Exon 2. Dort angekommen, schneidet er erneut, diesmal direkt vor dem Exon. Dann wirft er das Intron (Faden) weg und verbindet die beiden Exons miteinander: Exon1-Exon2. Und weiter geht’s: zum Ende von Exon2, durchschneiden, sich auf die Suche nach Exon3 machen, durchschneiden, Exons verbinden zu Exon1-Exon2-Exon3.

Und so weiter, bis er am Ende der NF1 RNA angelangt ist. Dann löst sich dieser Spleiß-Apparat wieder von der jetzt fertigen NF1 mRNA.

Damit dieser (ziemlich kompliziert aufgebaut) Spleiß-Apparat („Spliceosome“) schnell, genau und fehlerfrei arbeiten kann, muss er die Stellen, an denen er die NF1 RNA durchschneiden soll, sicher erkennen können.

Erkennung-Sequenzen für den Spleiß-Apparat auf der NF1 RNA

Dar Spleiß-Apparat braucht für sein fehlerfreies Funktionieren sichere „Erkennungssequenzen“ auf der NF1 RNA. Zwei sind wesentlich:

  • die erste „sagt“ dem Apparat: hier endet ein Exon, z.B. Exon1, (Perle 1), ab hier kannst du schneiden. Solche RNA Sequenzen nennt man „Splicedonorsite“. Alles dahinter ist Intron (Faden). Und
  • die zweite Erkennungssequenz „sagt“: hier endet die Intron-Sequenz das nächste Exon (Nr. 2) fängt an. Diese Sequenzen nennt man Spliceacceptorside. Für den Apparat heißt das: Intron durchschneiden, entsorgen, den Exon2 Anfang mit dem Ende von Exon1 verbinden. (die Perlen 1 und 2 würde man wahrscheinlich einfach verkleben).

Und so klappert der Spleiß-Apparat die ganze NF1 RNA ab, schneidet die Introns raus und setzt die Exons neu zusammen. Bei der NF1 RNA ist er gut beschäftigt, es geht um 51 Exons. Alles passiert rasend schnell. Fehler sind extrem selten.

Neuzusammensetzung der NF1 Exons

Setzt der Spleiß-Apparat diese NF1 Exon Sequenzen zusammen (also diese 51 „Perlen“), ergibt sich daraus die „kodierende Sequenz“, oder NF1 mRNA. Die bestimmt aus welchen Aminosäuren in welcher Reihenfolge das Neurofibromin in den Ribosomen zusammengesetzt wird.

NF1 Mutationen können Spleiß-Erkennung-Sequenzen betreffen

Mutationen im NF1 Gen können auch in diese für den Spleiß-Apparat wesentlichen NF1 RNA erfolgen. Zum Beispiel kann eines der Nukleotide (DNA-Bausteine, ATGC) der NF1 Sequenz ausgerechnet in so einer Spleiß-Sequenz verändert sein, z.B. ein A zu einem G mutiert sein. Solche Spleiß-Mutationen sind im NF1 Gen nicht selten: 44% alle NF1 Mutationen gehören in diese Kategorie.

NF1 Spleiß-Mutationen führen zu nicht mehr funktionierendem Neurofibromin

Folge davon ist, daß der Spleiß-Apparat diese mutierte NF1 Sequenz nicht als Spleiß-Erkennung-Sequenz erkennen kann und sich die nächste ihm bekannte Sequenz sucht. Folge: eine unsinnige NF1 RNA Sequenz.

Also z.B. in dem Beispiel von oben, wenn der Apparat eine Spleiß-Erkennung-Sequenz von Exon 2 wegen der Mutation nicht erkennt, käme anstelle von Exon1-Exon2-Exon3 als NF1 mRNA Sequenz Exon1-Exon3 raus. Exon 2 würde „vergessen“, wir sagen „geskipt“.

Und von so einer NF1 Sequenz entsteht in den Ribosomen kein sinnvolles Neurofibromin. Oft werden solche veränderten Neurofibromin-Moleküle, wenn sie in den Ribosomen gebildet, vorzeitig abgebaut oder funktionieren nicht richtig, haben also nicht die normale Neurofibromin Aktivität.

In den Versuchen von Kesterson geht es um eine solche NF1 Spleiß-Mutation, eine im NF1 Exon 13.

Die Spleiß-Mutation in NF1 Exon13 in den Versuchen von Kesterson

Das NF1 Gen hat 51 Exons. Bei einigen NF1 Betroffenen wurde im NF1 Exon13 eine Mutation festgestellt, die sich auf das Spleißen auswirkt. Im Exon13 ist an der Position 1466 anstelle von einem A ein G.

Diese NF1 Mutation hat zwei komplexe Konsequenzen:

  • durch die Mutation wird die Aminosäuresequenz an einer Position des Neurofibromins direkt verändert. An der Position 486 der 2838 Aminosäuren enthaltenen Neurofibromin ist jetzt anstelle der Aminosäure Tyrosin die Aminosäure Cystein. Das „geringfügig veränderte Neurofibromin“ ist vielleicht instabiler oder weniger aktiv.
  • Zusätzlich entsteht mitten im Exon13 eine neue Spleißdonor-Sequenz, 64 Nukleotide vor der eigentlichen Spleißdonor-Sequenz. Voraussichtlich verändert sich NF1 Spleißen. Infolgedessen verändert sich auch die Bildung des Neurofibromins: ein anderes gar nicht brauchbares Neurofibromin entsteht.

Diese Mutation wird von der Gruppe von Kesterson als Beispiel für den Versuch benutzt, die Folgen einer NF1 Spleiß-Mutation zu korrigieren.  

Verändertes Spleißen durch die Mutation in NF1 Exon13

Sehen wir uns den Effekt auf das NF1 Spleißen an: durch die veränderte NF1 RNA Sequenz verändert sich das Spleißen im Exon13. Der Spleiß-Apparat erkennt die neue (mutierte) NF1 RNA Sequenz als ein (neues) (Spleißdonor) Signal, ab hier zu spleißen. Es kommt zu einem vorzeitigen Spleißen („Aberranten Spleißen“).

Die neue Spleiß-Donorsequenz von Exon13 wir durch den Spleiß-Apparat mit der (normalen) Spleiß-Akzeptorsequenz von Exon14 verbunden. So entsteht eine neue NF1 mRNA Sequenz, …Exon13_verkürzt-Exon14….

Diese neue mutierte NF1 mRNA 2 ist 62 Nukleotide kürzer als die normale NF1 mRNA. Also ist auch das gebildete Neurofibromin kürzer als das normale. 

Nun könnte man sagen, nun gut, dann ist sie eben kürzer. Macht das was?

In diesem Fall leider ja. Es kommt nämlich zu einer „Leserasterverschiebung“ bei der Zusammensetzung der Aminosäuren. Also, z.B. aus

  • „Eine Neurofibromatose zu haben ist aergerlich“, wird
  • „Eine Neu enis taer gerl ich“,

also unverständlich

Wie kann man das falsche Spleißen in NF1 Exon13 korrigieren?

Von der Arbeitsgruppe von Kesterson wurde gezeigt, dass man diese NF1 Mutation in Exon13 durch den Einsatz von kleinen künstlichen Oligonukleotiden in NF1 Zellkulturen so beeinflussen kann, dass das Fehlspleißen unterbleibt. Die Folgen der NF1 Mutation können so weitgehend aufgehoben werden.

Wie geht das?

NF1 Exon13 Mutationsspezifische PMOs

Die kleinen einzelsträngigen 25 langen Oligonukleotide sind so konstruiert, dass sie an die NF1-RNA im Bereich der NF1 Mutation im Exon13 binden können. Sie sind künstlich modifiziert, Morpholinos oder PMO (Phosphordiamidat-Morpholino-Oligomer) nennt man sie. Sie binden sehr gut an die NF1 RNA und sind gegen den Abbau in der Zelle geschützt.

Bietet man NF1 Zellen mit dieser Mutation im NF1 Exon13 diese PMOs an, gelangen diese in den Zellkern und binden an die mutierte NF1RNA. Man kann sich das vielleicht, wie eine Art kurzes „Pflaster“ vorstellen, das die mutierte RNA Sequenz bedeckt und für den Spleiß-Apparat nicht mehr erkennbar macht. 

Das führt dazu, dass der Spleiß-Apparat auf der Suche nach der nächsten Spleiß-Sequenz die mutierte Sequenz gleitet, ohne sie zu erkennen. Er bindet dann ganz normal am Ende des Exon13, schneidet das dahinterliegende Intron raus und verbindet Exon 13 und Exon 14, als sei alles normal. Eine NF1 mRNA entsteht.

Dies eigentlich mutierte NF1 Transkript gelangt in die Ribosomen, und ein verändertes Neurofibromin entsteht, eben eines, das an Position 486 anstelle der Aminosäure Tyrosin die Aminosäure Cystein aufweist.

Und diese NF1 Spleiß-Korrektur hat funktioniert

Die Forschungs Gruppe kann zeigen, dass diese künstliche Spleiß-Korrektur funktioniert. Nach Inkubation der NF1 Zellen mit der Mutation im Exon 13 mit den spezifischen PMO

  • weist die NF1 mRNA wieder ihre normale Länge auf
  • hat das gebildete Neurofibromin wieder seine normale Länge
  • ist das gebildete Neurofibromin funktionsfähig und hat seine normale Aktivität, soweit man das messen kann.

Einiges ist noch offen, aber im Prinzip hat es wunderbar geklappt.

Was heißt das?

Die Arbeit zeigt, dass man an Zellkulturen mit einer spezifischen NF1 Spleiß-Mutation die Spleiß-Fehler korrigieren kann, wenn man spezifische PMOs einsetzt. Die NF1 Zellen verhalten sich wieder wie Zellen von Gesunden. 

Ich halte diese Arbeit für einen großen Fortschritt.

Als nächstes wird man ausprobieren müssen, ob dieser Ansatz auch in einem lebendigen Organismus funktioniert, also z.B. in einer NF1 Maus mit dieser spezifischen NF1 Mutation. Die Arbeitsgruppe hat sich eine solche genetisch veränderte NF1 Maus schon geschaffen. Hier wird man sicher noch viel lernen müssen:

  • Funktioniert das in alle Zellen der Maus?
  • Wie kann man den Mäusen diese PMOs zuführen?
  • Gibt es unerwartet Effekte?
  • Haben diese PMOs auf die bei NF1 Mäusen bekannten NF1 Symptome?
  • Was muss man modifizieren?

Schritt für Schritt wird das gelöst werden. Also, ein erster wunderbarer Schritt, mit ermöglicht durch die Initiative und die Mittel des gemeinnützigen Vereins Nothing is Forever. Weiterer Sponsor dieses Projektes ist mittlerweile die Gilbert Family Foundation (www.gilbertfamilyfoundation.org), welche von dem US-amerikanischen Unternehmer Dan Gilbert und seiner Frau Jennifer gegründet wurde.

Den vollständigen wissenschaftlichen Artikel können Sie hier aufrufen bzw. downloaden:

Der große Erfolg eines von Nothing is Forever e.V. ins Leben gerufenen und mitfinanzierten Projektes